小鼠全脑透明化成像流程

一、灌注及取材

   小鼠腹部注射溶波麻醉实验小鼠（90mg/kg）；待小鼠麻醉后，从心脏先后灌注充足的PBS与预冷的4%HMS；灌流结束后，解剖取脑置于4%HMS溶液中固定1-2天。

二、包埋聚合

  将样品浸泡于4% HMS中固定1-2天，使样品质地更硬，不易切碎；将固定后的样品包埋在水凝胶中放置37℃烘箱聚合，方便后续切片处理，且可以保持组织形态不易变形。最后将聚合好的样品（如图a）用PBS室温洗涤。

三、切片

  将组织块靠近粘在切片机附带的样品管底部（如图b），然后往样品管内空余地方填充预热后成液态的4%琼脂糖溶液，并将样品管置于冰上冷却，直至琼脂糖凝固；将样品管正确安置在百会拓知自主研发的B-S-1018振动切片机上，使用切片机精确连续切割，制作成300μm的均匀厚片依次收集至孔板，以供后续成像使用。

四、透膜及清洗

  将孔板中加入透膜溶液（如图c），将孔板用封口膜封口，放置在37℃烘箱内的摇床上，轻微摇晃24小时;透膜完成后将样品放置室温摇床上清洗24h，每隔4-8h换液，共3次。

五、荧光染色（可选）

  透明化完成后的样品根据不同客户不同需求进行免疫荧光染色。采用常规免疫染色步骤进行染色。染色后的样品使用含0.3% Triton X-100的PBST室温清洗清洗三次（每次间隔1h），之后用PBS室温洗涤组织2次（每次间隔1h）。

六、DAPI染色（可选）

  将清洗后的样品每孔加入DAPI染色液，放置于37℃摇床上轻微摇晃孵育24h。取出孵育好的样品室温清洗3次，每次间隔3~4h。

七、贴片

  将300μm厚的脑片从孔板里的保存液中捞出，平贴在下玻片上；贴片时要确保样本平整，减少成像误差。贴好后（如图d）用4% HMS封片（此过程应尽量避免气泡产生），将贴好的片子置于密封盒内，转移至37℃烘箱，聚合4小时。将密封盒转移到通风橱中，拿出贴片槽，放入PBS中避光清洗，轻微摇晃，隔4-8小时换液一次，换3次，清洗24小时。

八、匹配过夜

  将待成像样品放入成像槽，加入匹配液到成像槽中，使样品都浸没到匹配液。盖上盖子，避免灰尘异物掉落进成像槽中污染样品。室温摇床上以小于60 rpm的速度进行折射率匹配放置过夜。匹配后脑片呈现状态会由图d变成图e，呈现出透明状。

九、大样品高速三维荧光显微成像系统（VISOR）成像

  利用最新的VISoR技术捕捉高分辨率图像，可在半小时内可以以1×1×2.5 μm3 的分辨率完成完整鼠脑的三维荧光成像。成像前检查成像槽上的样品表面以及匹配液中是否有毛毛、异物、气泡；调整并检查滤光片位置；定位样品x、y、z轴；调焦到清晰的画面；随后在1×1×2.5 μm3 的分辨率下完成完整鼠脑的三维荧光成像。

十、交付重构的三维成像、原始数据以及数据分析结果

  我们通过搭建的高性能计算集群，以及自主开发的算法和软件，实现了对PB级图像大数据的存储、管理和多种分析，包括图像拼接、三维重构、图谱配准和神经元形态重建等。